Agarwood knowledge

There are thirteen species of Aquilaria producing agarwood, a product of plant and microbe interaction. The process of natural formation of agarwood is slow and only 10 percent of the trees in wild get infected forming agarwood. Since commercial cultivation of agarwood has begun, there is a need for a supporting programme of artificial induction to make the programme viable. The paper reviews the methods of biological induction in Aquilaria sp., the role of endophytes especially species of Fusarium and the availability of inocula for inducing agarwood formation.

Có 13 loài Dó bầu tạo ra trầm hương, một sản phẩm của sự tương tác giữa thực vật và vi khuẩn. Quá trình hình thành trầm hương tự nhiên diễn ra chậm và chỉ có 10% số cây trong tự nhiên bị nhiễm bệnh hình thành trầm hương. Kể từ khi việc trồng trầm hương thương mại đã bắt đầu, cần có một chương trình hỗ trợ kích thích nhân tạo để làm cho chương trình trở nên khả thi. Bài báo đánh giá các phương pháp cảm ứng sinh học ở Dó bầu, vai trò của vi sinh vật nội sinh, đặc biệt là loài Fusarium và nguồn giống sẵn có để kích thích hình thành trầm hương.

Aquilaria is a genus belonging to the family Thymelaeaceae, yielding a resin impregnated heartwood called agarwood, which is a highly valuable, fragrant, dark resinous product used as incense, in perfumery and as medicine in many traditional systems. It is an important non-timber forest product in international trade. Unsustainable logging and smuggling of agarwood from the natural forests is the reason for its decreasing natural population. Aquilaria malaccensis is the first species of the genus Aquilaria to be listed under Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora (CITES) Appendix II in 1995 and now all the species of Aquilaria are listed in the same Appendix since 2004. Aquilaria is categorized as ‘Vulnerable’ by the International Union for the Conservation of Nature (IUCN, 2009) and Aquilaria malaccensis was downgraded from ‘Vulnerable’ to ‘Critically Endangered’ in 2018 due to continued unsustainable exploitation (Harvey-Brown, 2018).

Aquilaria species yielding agarwood are found only in the areas ranging from India eastwards throughout southeast Asia and in southern China, with Indonesia and Malaysia being the two major agarwood producing countries. Out of 21 species of Aquilaria, 13 are agarwood-producing, viz., Aquilaria acuminata, A. apiculata, A. baillonii, A. banaensae, A. beccariana, A. brachyantha, A. crassna, A. cumingiana, A. filaria, A. grandiflora, A. hirta, A. khasiana, A. malaccensis, A. microcarpa, A. rostrata, A. sinensis and A. subintegra (Lee & Mohamed, 2016). In India there are two species of Aquilaria, namely Aquilaria malaccensis widely cultivated and A. khasiana having a restricted distribution in Khasi hills of Meghalaya. Aquilaria malaccensis occurs naturally mostly in the foothills of northeastern region except Sikkim as well as northern part of West Bengal.

Trầm hương là một chi thuộc họ Thymelaeaceae, có tâm gỗ tẩm nhựa gọi là trầm hương, là một sản phẩm nhựa có màu tối, thơm, có giá trị cao được sử dụng làm hương, nước hoa và làm thuốc trong nhiều hệ thống truyền thống. Đây là lâm sản ngoài gỗ quan trọng trong thương mại quốc tế. Việc khai thác và buôn lậu trầm hương không bền vững từ rừng tự nhiên là nguyên nhân làm giảm dân số tự nhiên của loài này. Aquilaria malaccensis là loài đầu tiên thuộc chi Aquilaria được liệt kê trong Công ước về buôn bán quốc tế các loài động, thực vật hoang dã có nguy cơ tuyệt chủng (CITES) Phụ lục II năm 1995 và hiện nay tất cả các loài Aquilaria đều được liệt kê trong cùng một Phụ lục kể từ năm 2004. được Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN, 2009) phân loại là 'Dễ bị tổn thương' và Aquilaria malaccensis đã bị hạ cấp từ 'Dễ bị tổn thương' xuống 'Cực kỳ nguy cấp' vào năm 2018 do tiếp tục khai thác không bền vững (Harvey-Brown, 2018).

Các loài trầm hương chỉ được tìm thấy ở các khu vực từ Ấn Độ về phía đông khắp Đông Nam Á và miền nam Trung Quốc, với Indonesia và Malaysia là hai nước sản xuất trầm hương lớn. Trong số 21 loài Dó bầu, có 13 loài sản xuất trầm hương, viz., Aquilaria acuminata, A. apiculata, A. baillonii, A. banaensae, A. beccariana, A. brachyantha, A. crassna, A. cumingiana, A. filaria , A. grandiflora, A. hirta, A. khasiana, A. malaccensis, A. microcarpa, A. rostrata, A. sinensis và A. subintegra (Lee & Mohamed, 2016). Ở Ấn Độ có hai loài Dó bầu là Aquilaria malaccensis được trồng rộng rãi và A. khasiana có phân bố hạn chế ở vùng đồi Khasi của Meghalaya. Aquilaria malaccensis xuất hiện tự nhiên chủ yếu ở chân đồi vùng đông bắc ngoại trừ Sikkim cũng như phần phía bắc của Tây Bengal.

Induction of agarwood production

Production of agarwood is mainly the result of plant-microbes interaction, induced by external factors such as physical injury, insect damage or microbial infection. Aquilaria trees may take several years to make agarwood around the wound naturally (Zhang et al., 2012). Further, only about 10% of the trees in a population get infected and form agarwood naturally (Soehartono & Newton, 2000). Due to high economic and medicinal values of agarwood and the resultant demand, different strategies have been devised to produce agarwood artificially in a short period of time. The causal agents associated with production of agarwood can be physical, chemical and biological. The history and perspectives of induction technology for agarwood production from cultivated Aquilaria in Asia have been recently reviewed (Azren et al., 2019). The relative advantages and disadvantages of these methods have also been reviewed recently discussing the current developments and future perspectives (Tan et al., 2019; Shivanand et al., 2022).

Việc sản xuất trầm hương chủ yếu là kết quả của sự tương tác giữa thực vật và vi khuẩn, gây ra bởi các yếu tố bên ngoài như chấn thương vật lý, côn trùng gây hại hoặc nhiễm vi khuẩn. Cây bầu có thể phải mất vài năm mới tạo ra trầm hương xung quanh vết thương một cách tự nhiên (Zhang và cộng sự, 2012). Hơn nữa, chỉ có khoảng 10% số cây trong quần thể bị nhiễm bệnh và hình thành trầm hương một cách tự nhiên (Soehartono & Newton, 2000). Do giá trị kinh tế và dược liệu cao của trầm hương và nhu cầu cao, các chiến lược khác nhau đã được đưa ra để sản xuất trầm hương nhân tạo trong một khoảng thời gian ngắn. Các tác nhân gây ra trầm hương có thể là vật lý, hóa học và sinh học. Lịch sử và quan điểm của công nghệ cảm ứng để sản xuất trầm hương từ Dó bầu được trồng ở Châu Á đã được xem xét gần đây (Azren và cộng sự, 2019). Những ưu điểm và nhược điểm tương đối của các phương pháp này cũng đã được xem xét gần đây khi thảo luận về những phát triển hiện tại và triển vọng trong tương lai (Tan và cộng sự, 2019; Shivanand và cộng sự, 2022).

Cutting, cauterizing, holing, nailing, axe chopping, wounding using chisels and bark removal have been used as physical modes (Pojanagaroon & Kaewrak, 2003; Chhipa, Chowdhary & Kaushik, 2017). Although this approach is cost effective and requires only one person for handling, it usually results in inferior quality of agarwood and uncertain yield (Tan et al., 2019). A modification of the physical method is wounding and keeping the wound active by aeration through insertion of pipes of plastic, bamboo or wood, to a depth of 1-10 cm into the xylem, as a series of closely spaced wounds in a spiral fashion, from ground to the crown, wounds positioned 5 cm apart. In the same method, chemical induction can also be combined or biological inducers can also be inserted, but keeping the wound fresh by aeration and the tree alive are important (Blanchette & van Beek, 2005).

Cắt, đốt, đóng đinh, chặt bằng rìu, gây thương tích bằng đục và loại bỏ vỏ cây đã được sử dụng làm phương thức vật lý (Pojanagaroon & Kaewrak, 2003; Chhipa, Chowdhary & Kaushik, 2017). Mặc dù phương pháp này tiết kiệm chi phí và chỉ cần một người xử lý nhưng nó thường dẫn đến chất lượng trầm hương kém hơn và năng suất không ổn định (Tan và cộng sự, 2019). Một sửa đổi của phương pháp vật lý là làm vết thương và giữ cho vết thương hoạt động bằng cách thông khí thông qua việc chèn các ống nhựa, tre hoặc gỗ, đến độ sâu 1-10 cm vào xylem, như một loạt các vết thương có khoảng cách gần nhau theo kiểu xoắn ốc, từ mặt đất đến thân răng, các vết thương cách nhau 5 cm. Theo phương pháp tương tự, cảm ứng hóa học cũng có thể được kết hợp hoặc cũng có thể đưa vào các chất cảm ứng sinh học, nhưng việc giữ cho vết thương tươi mới bằng cách sục khí và cây vẫn sống là điều quan trọng (Blanchette & van Beek, 2005).

Chemicals such as sulphuric acid, acetic acid, alcohol, methyl jasmonate, soybean oil, jaggery, sodium bisulphate, yeast extract, iron powder, sodium chloride, formic acid, hydrogen peroxide and salicylic acid have been used as chemical inducers for production of agarwood (Chen et al., 2011; Wei et al., 2012; Ito et al., 2005). An alternate method of agarwood production patented in China is called the whole-tree agarwood induction technology (Agar-Wit) wherein a degradable chemical solution is injected into the xylem of A. sinensis trees through the transfusion sets, and it induces high quality agarwood production in just 20 months with very high similarity to wild agarwood in terms of quality, including chemical constituents, ethanol-soluble extract content and essential oil content (Zhang et al., 2012). A combination of both the physical and chemical methods has also been attempted which improved the agarwood yield in comparison to natural process (Pojanagaroon & Kaewrak, 2003).

Nhiều vi sinh vật nội sinh cư trú trong mô thực vật và đóng vai trò quan trọng trong sinh lý thực vật. Nhìn chung, chúng có tính cơ hội và thiết lập mối quan hệ cộng sinh với thực vật; chúng có thể được phân lập từ bề mặt hoặc từ bên trong các bộ phận của cây. Tuy nhiên, một số vi sinh vật nội sinh có khả năng gây bệnh tiềm ẩn ở các loài thực vật, tức là trong những điều kiện cụ thể có thể biến thành mầm bệnh. Ở Aquilaria, khả năng gây bệnh tiềm ẩn của vi khuẩn nội sinh này rất hữu ích về mặt kinh tế vì nó kích thích sản xuất nhựa dầu. Vai trò của nội sinh trong việc hình thành trầm hương trước đó đã được xem xét (Enshasy và cộng sự, 2019). Một đánh giá gần đây đã chỉ ra rằng 59 chủng nấm nội sinh thuộc 16 chi tạo ra trầm hương, hầu hết thuộc chi Fusarium (Du et al., 2022). Tuy nhiên, một đánh giá khác về nấm nội sinh được tìm thấy ở các loài Aquilaria và Gyrinops, chủ yếu từ Trung Quốc và Ấn Độ đã liệt kê 71 loài, trong đó 9 loài có thể tạo ra trầm hương, viz., Botryosphaeria sp., Chaetomium sp., Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium sp. ., Nemania aquilariae, Penicillium sp., Pestalotiopsis sp., Trichoderma sp. và Xylaria sp. (Zhang và cộng sự, 2022).

For biological induction of agarwood production, there are various well-established methods. The advantage of biological induction is that it is progressive and systematic growth of fungal agents results in continuous formation of agarwood (Novriyanti et al., 2010). The fungal inoculation can be induced by drilling the tree and injecting the inoculum. In this method, the wound closes after some time and therefore to keep it open and allow flow of inoculum continuously the bottle drip method, where fungal inoculum is kept in bottles hung upside down, allowing slow seepage of inoculum continuously, has been devised (Tang, 2012; Justin et al., 2020). By suitable selection of fungal strains high grade agarwood can be produced in substantial quantities (Turjaman, Hidayat & Santoso, 2016). A further improvement in biological method is the pinhole infusion (Tian et al., 2013) wherein formic acid is used as a chemical inducer along with culture of Botryosphaeria dothidea, a combination of chemical and biological methods to collectively improve the resin formation. In this review, the role of microbes such as the endophytes occurring naturally in the host Aquilaria and also the artificially inoculated microbes for production of agarwood, especially in India, have been elaborated.

Để kích thích sinh học sản xuất trầm hương, có nhiều phương pháp đã được chứng minh rõ ràng. Ưu điểm của cảm ứng sinh học là sự phát triển lũy tiến và có hệ thống của các tác nhân nấm dẫn đến sự hình thành trầm hương liên tục (Novriyanti et al., 2010). Việc tiêm nấm có thể được thực hiện bằng cách khoan cây và tiêm chất cấy vào cây. Trong phương pháp này, vết thương sẽ đóng lại sau một thời gian và do đó giữ cho nó mở và cho phép chất cấy chảy liên tục. Phương pháp nhỏ giọt trong chai, trong đó chất cấy nấm được giữ trong các chai treo ngược, cho phép chất cấy thấm chậm liên tục, đã được phát minh ra (Tang , 2012; Justin và cộng sự, 2020). Bằng cách lựa chọn các chủng nấm thích hợp, trầm hương chất lượng cao có thể được sản xuất với số lượng đáng kể (Turjaman, Hidayat & Santoso, 2016). Một cải tiến hơn nữa trong phương pháp sinh học là truyền vào lỗ kim (Tian và cộng sự, 2013), trong đó axit formic được sử dụng làm chất cảm ứng hóa học cùng với nuôi cấy Botryosphaeria dothidea, một sự kết hợp giữa phương pháp hóa học và sinh học để cải thiện tổng thể sự hình thành nhựa. Trong tổng quan này, vai trò của các vi khuẩn như vi sinh vật nội sinh xuất hiện tự nhiên trong cây Dó bầu và cả các vi khuẩn được cấy nhân tạo để sản xuất trầm hương, đặc biệt là ở Ấn Độ, đã được trình bày chi tiết.

Artificial induction of agarwood using microbes /Cảm ứng nhân tạo trầm hương bằng vi khuẩn

Artificial induction using fungi isolated from agarwood was first attempted by Tunstall in 1929 (Gibson, 1977). Schuitemaker (1933) suggested the possibility of a “pathological occurrence of which the cause was unknown” related to formation of agarwood in Borneo. He suggested possibility of inducing agarwood formation by inserting freshly cut agarwood into the stem of a healthy tree. The experiment of Tunstall was reviewed and the nature of agar formation was first discussed by Bose (1938), who also examined the feasibility of agaru formation by fungal inoculation using pure culture of Cladosporium sp. (Bose, 1943, 1962). In 1940 he sent the inoculum to the Forest department of Assam and after inoculation fungal hyphae had developed and drops of resin were seen under microscope. By distillation, he was able to obtain oil with agar smell, and this is the first instance of artificial induction of agarwood in Assam (MacKarness, 1941). Bhattacharyya, Datta and Baruah (1952) reported that the formation of agarwood is possibly due to the presence of microbes in the wood, and the fungus Epicoccum granulatum is responsible for agarwood production. Saikia (1956) attempted artificial inoculation to promote formation of agarwood, in Assam. Similarly, Jalaluddin (1977) isolated Cytosphaera mangiferae from diseased tissues in standing trees of Aquilaria agallocha and used them for artificial inoculation.

Cảm ứng nhân tạo sử dụng nấm phân lập từ trầm hương được Tunstall thử nghiệm lần đầu tiên vào năm 1929 (Gibson, 1977). Schuitemaker (1933) đề xuất khả năng “xuất hiện bệnh lý mà nguyên nhân chưa được biết” liên quan đến sự hình thành trầm hương ở Borneo. Ông đề xuất khả năng tạo ra trầm hương bằng cách cắm trầm hương mới cắt vào thân cây khỏe mạnh. Thí nghiệm của Tunstall đã được xem xét lại và bản chất của sự hình thành agar lần đầu tiên được thảo luận bởi Bose (1938), người cũng đã kiểm tra tính khả thi của việc hình thành agaru bằng cách cấy nấm bằng cách nuôi cấy thuần khiết Cladosporium sp. (Bose, 1943, 1962). Năm 1940, ông gửi chất cấy đến Cục Lâm nghiệp Assam và sau khi cấy, sợi nấm đã phát triển và người ta nhìn thấy những giọt nhựa dưới kính hiển vi. Bằng cách chưng cất, ông đã có thể thu được dầu có mùi agar, và đây là trường hợp đầu tiên về cảm ứng nhân tạo của trầm hương ở Assam (MacKarness, 1941). Bhattacharyya, Datta và Baruah (1952) báo cáo rằng sự hình thành trầm hương có thể là do sự hiện diện của vi khuẩn trong gỗ và nấm Epicoccum granulatum chịu trách nhiệm sản xuất trầm hương. Saikia (1956) đã thử tiêm chủng nhân tạo để thúc đẩy sự hình thành trầm hương ở Assam. Tương tự, Jalaluddin (1977) đã phân lập Cytosphaera mangiferae từ các mô bệnh trên cây Aquilaria agallocha đứng và sử dụng chúng để cấy nhân tạo.

However, in a study in Sylhet region of Bangladesh, Gibson (1977) observed the presence of Penicillium sp. and Aspergillus sp. in all the infected and mechanically injured wood and suggested that there is no consistency in the range of fungi observed in the agarwood deposits collected, and therefore agarwood formation may be in response to wounding, followed by invasion of weak fungal pathogens, rather than a specific response to fungal attack. Similarly, Rahman and Basak (1980) also observed that there is no specific fungus which causes agarwood production, but is a general reaction of the host to injury and invasion. They also postulated that presence of exposed open wound is more important than presence of certain species of fungi within the wound, for the formation of agarwood.

Tuy nhiên, trong một nghiên cứu ở vùng Sylhet của Bangladesh, Gibson (1977) đã quan sát thấy sự hiện diện của Penicillium sp. và Aspergillus sp. trong tất cả các gỗ bị nhiễm bệnh và bị tổn thương cơ học và cho rằng không có sự nhất quán về phạm vi của các loại nấm được quan sát thấy trong trầm hương được thu thập, và do đó sự hình thành trầm hương có thể là phản ứng với vết thương, sau đó là sự xâm nhập của các mầm bệnh nấm yếu, chứ không phải là một loại cụ thể. phản ứng với sự tấn công của nấm. Tương tự, Rahman và Basak (1980) cũng quan sát thấy rằng không có loại nấm cụ thể nào gây ra sự sản sinh trầm hương mà là phản ứng chung của vật chủ trước tổn thương và xâm lấn. Họ cũng công nhận rằng sự hiện diện của vết thương hở lộ ra quan trọng hơn sự hiện diện của một số loài nấm trong vết thương, đối với sự hình thành trầm hương.

The combined effect of physical and biological stress in the form of stick method to improve agarwood production in Aquilaria malaccensis has been explored and compared with well-known artificial fungal infection by syringe method. In total 21 fungal strains were applied alone (syringe method) and with bamboo sticks (stick method). Maximum infection in stick method was by Penicillium polonicum. Penicillium aethiopicum has shown high potential as agent in stick method for artificial production of agarwood (Chhipa & Kaushik, 2020).

Tác dụng kết hợp giữa stress vật lý và sinh học dưới dạng phương pháp dùng que để cải thiện khả năng sản xuất trầm ở cây Dó bầu malaccensis đã được khám phá và so sánh với phương pháp lây nhiễm nấm nhân tạo phổ biến bằng phương pháp ống tiêm. Tổng cộng có 21 chủng nấm được áp dụng riêng (phương pháp ống tiêm) và bằng que tre (phương pháp que). Nhiễm nhiều nhất trong phương pháp dính là Penicillium polonicum. Penicillium aethiopicum đã cho thấy tiềm năng cao như là tác nhân trong phương pháp dính để sản xuất trầm hương nhân tạo (Chhipa & Kaushik, 2020).

Plate 1. Some of the agarwood induction kits available in the market.

Endophytes and their role in agarwood production/Endophytes và vai trò của chúng trong sản xuất trầm hương

Many microbial endophytes dwell within plant tissues and play an important role in plant physiology. They are generally opportunistic and establish a symbiotic relationship with plants; they can be isolated from the surface or from inside the plant parts. However, some endophytes show latent pathogenicity in plant species, i.e., under specific conditions can turn into pathogens. In Aquilaria this latent pathogenicity of endophytes is economically useful, as it induces oleoresin production. The role of endophytes in the formation of agarwood has earlier been reviewed (Enshasy et al., 2019). A recent review has indicated that 59 endophytic fungal strains of 16 genera induce agarwood production, most of which belong to the genus Fusarium (Du et al., 2022). Yet another review of endophytic fungi found in species of Aquilaria and Gyrinops, mainly from China and India has listed 71 species, of which 9 were able to induce agarwood formation, viz., Botryosphaeria sp., Chaetomium sp., Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium sp., Nemania aquilariae, Penicillium sp., Pestalotiopsis sp., Trichoderma sp. and Xylaria sp. (Zhang et al., 2022).

Nhiều vi sinh vật nội sinh cư trú trong mô thực vật và đóng vai trò quan trọng trong sinh lý thực vật. Nhìn chung, chúng có tính cơ hội và thiết lập mối quan hệ cộng sinh với thực vật; chúng có thể được phân lập từ bề mặt hoặc từ bên trong các bộ phận của cây. Tuy nhiên, một số vi sinh vật nội sinh có khả năng gây bệnh tiềm ẩn ở các loài thực vật, tức là trong những điều kiện cụ thể có thể biến thành mầm bệnh. Ở Aquilaria, khả năng gây bệnh tiềm ẩn của vi khuẩn nội sinh này rất hữu ích về mặt kinh tế vì nó kích thích sản xuất nhựa dầu. Vai trò của nội sinh trong việc hình thành trầm hương trước đó đã được xem xét (Enshasy và cộng sự, 2019). Một đánh giá gần đây đã chỉ ra rằng 59 chủng nấm nội sinh thuộc 16 chi tạo ra trầm hương, hầu hết thuộc chi Fusarium (Du et al., 2022). Tuy nhiên, một đánh giá khác về nấm nội sinh được tìm thấy ở các loài Aquilaria và Gyrinops, chủ yếu từ Trung Quốc và Ấn Độ đã liệt kê 71 loài, trong đó 9 loài có thể tạo ra trầm hương, viz., Botryosphaeria sp., Chaetomium sp., Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium sp. ., Nemania aquilariae, Penicillium sp., Pestalotiopsis sp., Trichoderma sp. và Xylaria sp. (Zhang và cộng sự, 2022).

Besides fungi, bacteria have also been isolated from the infected trees and have been found to play a role in agarwood formation. Bhore, Praveena and Kandasamy (2013) isolated and identified 18 culturable endophytic bacteria associated with 7 Aquilaria sp. from Malaysia, viz., A. beccariana, A. crassna, A. hirta, A. malaccensis, A. microcarpa, A. sinensis and A. subintegra. Bacillus pumilus was dominant of all the culturable endophytic bacteria. Others were Acinetobacter radioresistens, Bacillus altitudinis, B. anthracis, B. arbutinivorans, B. arsenicus, B. aryabhattai, B. cereus, B. licheniformis, B. megaterium, B. methylotrophicus, B. stratosphericus, B. subtilis, B. tequilensis, Pantoea agglomerans, Rahnella aquatilis, Roseomonas mucosa and Vibrio cholera. Nguyen and Nguyen (2014) identified 26 bacterial isolates divided into 7 groups associated with Aquilaria crassna, the dominant species being Bacillus pumilus and Alcaligenes faecalis. Chhipa and Kaushik (2017) studied the fungal and bacterial diversity from A. malaccensis tree as well as soil collected from different sites of Assam, and found that in stem Hypocreaceae is the dominant fungal family while Bacillaceae is the dominant bacterial family in both stem and soil isolates. Using bacterium Pantoea dispersa and fungus Penicillium polonicum, they induced agarospirol, the compound responsible for fragrance in agarwood, successfully. Phakeenuya et al. (2022) identified Pantoea dispersa as the dominant bacterium in the healthy wood of Aquilaria crassna. Fitriasari, Soetarta and Surata (2020) have suggested that use of lignocellulolytic bacteria can be more effective than the fungi as inoculants, as the bacteria can multiply faster than fungi, based on their study in Gyrinops versteegii.

Bên cạnh nấm, vi khuẩn cũng đã được phân lập từ những cây bị nhiễm bệnh và được phát hiện có vai trò trong việc hình thành trầm hương. Bhore, Praveena và Kandasamy (2013) đã phân lập và xác định được 18 vi khuẩn nội sinh có thể nuôi cấy được liên quan đến 7 loài Aquilaria sp. từ Malaysia, viz., A. beccariana, A. crassna, A. hirta, A. malaccensis, A. microcarpa, A. sinensis và A. subintegra. Bacillus pumilus chiếm ưu thế trong tất cả các vi khuẩn nội sinh nuôi cấy được. Các loài khác là Acinetobacter radioresistens, Bacillus altitudinis, B. anthracis, B. arbutinivorans, B. arsenicus, B. aryabhattai, B. cereus, B. licheniformis, B. megaterium, B. methylotrophicus, B. stratosphericus, B. subtilis, B. tequilensis, Pantoea agglomerans, Rahnella aquatilis, Roseomonas niêm mạc và Vibrio cholera. Nguyễn và Nguyễn (2014) đã xác định được 26 chủng vi khuẩn phân lập được chia thành 7 nhóm liên quan đến Aquilaria crassna, loài chiếm ưu thế là Bacillus pumilus và Alcaligenes faecalis. Chhipa và Kaushik (2017) đã nghiên cứu sự đa dạng của nấm và vi khuẩn từ cây A. malaccensis cũng như đất được thu thập từ các địa điểm khác nhau của Assam và phát hiện ra rằng ở thân cây Hypocreaceae là họ nấm chiếm ưu thế trong khi Bacillaceae là họ vi khuẩn chiếm ưu thế ở cả thân và thân. đất cách ly. Bằng cách sử dụng vi khuẩn Pantoea dispersa và nấm Penicillium polonicum, họ đã tạo ra thành công agarospirol, hợp chất tạo ra hương thơm trong trầm hương. Phakeenuya và cộng sự. (2022) đã xác định Pantoea dispersa là vi khuẩn chiếm ưu thế trong gỗ khỏe mạnh của Aquilaria crassna. Fitriasari, Soetarta và Surata (2020) đã gợi ý rằng việc sử dụng vi khuẩn lignocellulolytic có thể hiệu quả hơn nấm làm chế phẩm vì vi khuẩn có thể nhân lên nhanh hơn nấm, dựa trên nghiên cứu của họ ở Gyrinops versteegii.

There are several genera of fungi which have been found inducing agarwood development in Aquilaria, viz., Acremonium, Arthrinium, Aspergillus, Botryodiplodia, Botryosphaeria, Chaetomium, Colletotrichum, Cylindrocladium, Diaporthe, Diplodia, Epicoccum, Fusarium, Lasiodiplodia, Melanotus, Penicillium, Pestalotiopsis, Rhizopus, Rigidoporus, Trichoderma and Xylaria (Budi, Santoso & Wahyudi, 2010; Chen et al., 2017; Chong et al., 2015; Cui et al., 2013; Faizal et al., 2017; Lisdayani, Anna & Siregar, 2015; Monggoot et al., 2017; Santoso et al., 2011; Sen et al., 2017; Subasinghe, Hitihamu & Fernando, 2019; Tamuli et al., 2005; Tian et al., 2013; Zhang et al., 2012, 2014). Based on available literature, Xylaria sp., Lasiodiplodia sp., Colletotrichum sp. and Botryosphaeria sp. have been suggested as promising inoculants (Chhipa, Chowdhary & Kaushik, 2017). Fusarium has also been recommended as a good candidate for agarwood induction (Du et al., 2022).

Có một số chi nấm đã được tìm thấy gây ra sự phát triển trầm hương ở Aquilaria, viz., Acremonium, Arthrinium, Aspergillus, Botryodiplodia, Botryosphaeria, Chaetomium, Colletotrichum, Cylindrocladium, Diaporthe, Diplodia, Epicoccum, Fusarium, Lasiodiplodia, Melanotus, Penicillium, Pestalotiopsis , Rhizopus, Rigidoporus, Trichoderma và Xylaria (Budi, Santoso & Wahyudi, 2010; Chen và cộng sự, 2017; Chong và cộng sự, 2015; Cui và cộng sự, 2013; Faizal và cộng sự, 2017; Lisdayani, Anna & Siregar , 2015; Monggoot và cộng sự, 2017; Santoso và cộng sự, 2011; Sen và cộng sự, 2017; Subasinghe, Hitihamu & Fernando, 2019; Tamuli và cộng sự, 2005; Tian và cộng sự, 2013; Zhang và cộng sự. , 2012, 2014). Dựa trên tài liệu có sẵn, Xylaria sp., Lasiodiplodia sp., Colletotrichum sp. và Botryosphaeria sp. đã được đề xuất là chế phẩm có triển vọng (Chhipa, Chowdhary & Kaushik, 2017). Fusarium cũng được đề xuất là ứng cử viên tốt cho việc kích thích trầm hương (Du và cộng sự, 2022).

Studies on artificial induction of agarwood in India

In India, there have been several attempts at isolation and identification of the microbes associated with the species Aquilaria malaccensis, and their subsequent use in artificial induction. Tamuli et al. (2000) isolated Fusarium oxysporum and Chaetomium globosum from infected trees. Mitra and Gogoi (2000) isolated Botryodiplodia theobromae, Fusarium solani, Mucor hiemalis and Rosellina necatrix from the diseased agarwood caused by insect boring. Over and above the said fungi, they also isolated Aspergillus candidus, A. chevalieri, A. flavus, A. tamari, Epicoccum granulatum, Penicillium citrinum and Penicillium sp. from the agarwood induced by mechanical injuries. Puzari and Saikia (2000) studied the inner woody tissues after artificial inoculation with four different fungi, viz., Fusarium sp., F. oxysporum (Isolate No 1 and 2), Trichoderma sp. and one unidentified fungus, isolated from infected agar plants, and found oleoresin deposition. Barthakur, Mitra and Gogoi (2000) isolated 15 fungal species from the rhizosphere soil of trees growing naturally in undisturbed area and 9 fungal species in disturbed area, of which Mucor hiemalis, M. spinosus, Aspergillus ochraceous, Trichoderma album, T. koningii were common. Tamuli et al. (2005) successfully used Chaetomium globosum and Fusarium oxysporum for production of agarwood in Aquilaria malaccensis. Premalatha and Kalra (2013) found genera of endophytic fungi such as Cladosporium, Curvularia, Fusarium, Phaeoacremonium and Trichoderma as members of the agarwood community of Aquilaria malaccensis whereas only two taxa, i.e., Alternaria sp. and Trichoderma sp. were isolated from healthy wood, indicating that generally resinous wood contained high diversity of microflora in comparison to healthy wood. Nagajothi et al. (2016) found colonization by Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Lasiodiplodia and Chaetomium resulting in formation of agarwood. They analyzed cellulolytic activity, lignin degradation and laccase production by 17 fungal isolates among which Aspergillus niger showed highest activity for all three parameters. They suggested that enzymes produced by the pathogenic or saprophytic fungi could be playing a major role in defense mechanism which ultimately becomes responsible for agarwood production, and thus there is possibility to develop Aspergillus niger as an inoculant for agarwood production. Chhipa and Kaushik (2017) isolated the fungal and bacterial community from inside the stem of Aquilaria malaccensis and the surrounding soil from 21 different sites in Assam and explored their potential in inducing Agarospirol production by artificial infection. In total 340 fungi and 131 bacteria were isolated from 50 stem samples, and 188 fungi and 148 bacteria from 50 soil samples. 

Ở Ấn Độ, đã có một số nỗ lực phân lập và xác định các vi khuẩn liên quan đến loài Aquilaria malaccensis và việc sử dụng chúng sau đó trong cảm ứng nhân tạo. Tamuli và cộng sự. (2000) phân lập Fusarium oxysporum và Chaetomium globosum từ cây bị nhiễm bệnh. Mitra và Gogoi (2000) đã phân lập được Botryodiplodia theobromae, Fusarium solani, Mucor hiemalis và Rosellina necatrix từ trầm hương bị bệnh do côn trùng đục lỗ. Ngoài các loại nấm nói trên, họ còn phân lập được Aspergillus candidus, A. chevalieri, A. flavus, A. tamari, Epicoccum granulatum, Penicillium citrinum và Penicillium sp. từ trầm hương do chấn thương cơ học. Puzari và Saikia (2000) đã nghiên cứu các mô bên trong gỗ sau khi cấy nhân tạo với bốn loại nấm khác nhau, viz., Fusarium sp., F. oxysporum (Phân lập số 1 và 2), Trichoderma sp. và một loại nấm không xác định, được phân lập từ cây thạch bị nhiễm bệnh và tìm thấy sự lắng đọng nhựa dầu. Barthakur, Mitra và Gogoi (2000) đã phân lập được 15 loài nấm từ đất vùng rễ cây mọc tự nhiên ở vùng không bị xáo trộn và 9 loài nấm ở vùng bị xáo trộn, trong đó Mucor hiemalis, M. spinosus, Aspergillus ochraceous, Trichoderma album, T. koningii là chung. Tamuli và cộng sự. (2005) đã sử dụng thành công Chaetomium globosum và Fusarium oxysporum để sản xuất trầm hương ở Aquilaria malaccensis. Premalatha và Kalra (2013) đã tìm thấy các chi nấm nội sinh như Cladosporium, Curvularia, Fusarium, Phaeoacremonium và Trichoderma là thành viên của cộng đồng trầm hương của Aquilaria malaccensis trong khi chỉ có hai loài, tức là Alternaria sp. và Trichoderma sp. được phân lập từ gỗ khỏe mạnh, cho thấy rằng gỗ nhựa nói chung có hệ vi sinh vật đa dạng cao so với gỗ khỏe mạnh. Nagajothi và cộng sự. (2016) đã tìm thấy sự xâm chiếm của Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Lasiodiplodia và Chaetomium dẫn đến sự hình thành trầm hương. Họ đã phân tích hoạt động phân giải cellulose, phân hủy lignin và sản xuất laccase của 17 chủng nấm phân lập, trong đó Aspergillus niger cho thấy hoạt động cao nhất đối với cả ba thông số. Họ cho rằng các enzyme được tạo ra bởi nấm gây bệnh hoặc hoại sinh có thể đóng một vai trò quan trọng trong cơ chế bảo vệ mà cuối cùng trở thành nguyên nhân sản xuất trầm hương, và do đó có khả năng phát triển Aspergillus niger làm chế phẩm cho sản xuất trầm hương. Chhipa và Kaushik (2017) đã phân lập cộng đồng nấm và vi khuẩn từ bên trong thân cây Aquilaria malaccensis và vùng đất xung quanh từ 21 địa điểm khác nhau ở Assam và khám phá tiềm năng của chúng trong việc tạo ra Agarospirol bằng cách lây nhiễm nhân tạo. Tổng cộng có 340 loại nấm và 131 vi khuẩn được phân lập từ 50 mẫu thân cây, 188 loại nấm và 148 vi khuẩn từ 50 mẫu đất.

The dominant fungal genus in stem was Trichoderma while in soil Aspergillus was dominant. In bacteria, Bacillus genus showed dominance in both stem and soil samples. Forty fungal and bacterial isolates were assessed for their potential to induce agarwood formation in Aquilaria malaccensis and only 31% of bacterial and 23% of fungal isolates showed their ability in inducing Agarospirol production. Among bacteria Pantoea dispersa and among fungi Penicillium polonicum showed the highest production compared to other isolates. Chhipa, Chowdhary and Kaushik (2017) reviewed the genus wise occurrence of endophytic fungi and reported that Fusarium sp. showed highest presence in Aquilaria spp. The other fungal endophytes included Alternaria sp., Botryosphaeria sp., Cephalosporium sp., Chaetomium globosum, Cladophialophora sp., Cochliobolus lunatus, Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum sp., Coniothyrium nitidae, Cunninghamella bainieri, Curvularia sp., Cylindrocladium sp., Epicoccum sp., Fimetariella rabenhorstii A20, Geotrichum sp., Glomerularia sp., Gonytrichum sp., Guignardia mangiferae, Hypocrea lixii, Lasiodiplodia theobromae, Leptosphaerulina chartarum, Monilia sp., Mortierella sp., Mycelia sterilia sp., Mycosphaerella, Nigrospora oryzae, Nodulisporium sp., Ovulariopsis sp., Paraconiothyrium variabile, Penicillium sp., Phaeoacremonium, Phoma sp., Phomopsis sp., Pleospora sp., Ramichloridium sp., Rhinocladiella sp., Rhizomucor variabilis, Sagenomella sp. and Trichoderma sp. Pandey et al. (2017) found Phaeoacremonium parasiticum to be a promising candidate for agarwood induction through inoculation. Mochahari et al. (2020) isolated Alternaria sp., Curvularia sp., Rhizopus sp. and Sterilia sp. from one-year old Aquilaria malaccensis seedlings, and Penicillium sp., Fusarium sp. and one unidentified fungus putatively Cladosporium from agarwood chips. Kalra and Kaushik (2017) while reviewing the chemistry and quality of agarwood observed that most of the investigations on the chemical composition of agarwood have been with wild samples, and very little with resin produced using artificial methods, and also stated that the artificial induction methods have not ensured sustainable and quality supply of agarwood, calling for more extensive and streamlined research.

Loại nấm chiếm ưu thế ở thân là Trichoderma trong khi ở đất Aspergillus chiếm ưu thế. Ở vi khuẩn, chi Bacillus thể hiện sự thống trị ở cả mẫu thân và mẫu đất. Bốn mươi phân lập nấm và vi khuẩn đã được đánh giá về khả năng tạo ra trầm hương ở Aquilaria malaccensis và chỉ có 31% vi khuẩn và 23% phân lập nấm cho thấy khả năng tạo ra Agarospirol. Trong số vi khuẩn Pantoea dispersa và nấm Penicillium polonicum cho sản lượng cao nhất so với các chủng phân lập khác. Chhipa, Chowdhary và Kaushik (2017) đã xem xét sự xuất hiện của loài nấm nội sinh và báo cáo rằng Fusarium sp. cho thấy sự hiện diện cao nhất ở Aquilaria spp. Các nấm nội sinh khác bao gồm Alternaria sp., Botryosphaeria sp., Cephalosporium sp., Chaetomium globosum, Cladophialophora sp., Cochliobolus lunatus, Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum sp., Coniothyrium nitidae, Cunninghamella bainieri, Curvularia sp., Cylindrocladium sp., Epicoccum sp. ., Fimetariella rabenhorstii A20, Geotrichum sp., Glomerularia sp., Gonytrichum sp., Guignardia mangiferae, Hypocrea lixii, Lasiodiplodia theobromae, Leptosphaerulina Chartarum, Monilia sp., Mortierella sp., Mycelia sterilia sp., Mycosphaerella, Nigrospora oryzae, Nodulisporium sp ., Ovulariopsis sp., Paraconiothyrium variabile, Penicillium sp., Phaeoacremonium, Phoma sp., Phomopsis sp., Pleospora sp., Ramichloridium sp., Rhinocladiella sp., Rhizomucor variabilis, Sagenomella sp. và Trichoderma sp. Pandey và cộng sự. (2017) đã tìm thấy Phaeoacremonium parasiticum là một ứng cử viên đầy hứa hẹn cho việc tạo ra trầm hương thông qua việc tiêm chủng. Mochahari và cộng sự. (2020) phân lập Alternaria sp., Curvularia sp., Rhizopus sp. và Sterilia sp. từ cây giống Aquilaria malaccensis một năm tuổi và Penicillium sp., Fusarium sp. và một loại nấm không xác định được chính thức là Cladosporium từ dăm gỗ trầm hương. Kalra và Kaushik (2017) khi xem xét hóa học và chất lượng của trầm hương đã quan sát thấy rằng hầu hết các nghiên cứu về thành phần hóa học của trầm hương đều là với các mẫu tự nhiên và rất ít với nhựa được sản xuất bằng phương pháp nhân tạo, đồng thời cũng cho rằng phương pháp cảm ứng nhân tạo chưa đảm bảo cung cấp trầm hương bền vững và chất lượng, đòi hỏi phải nghiên cứu sâu rộng và hợp lý hơn.

Role of Fusarium species

Analysis of the various studies on isolation of microbes and their use in induction of agarwood, indicates that Fusarium is the most common microbe. Fusarium sp. is the most widely isolated followed by Cladophialophora sp. from Aquilaria sp. (Chhipa & Kaushik, 2017). Isolates of Fusarium sp., have been evaluated for their potential in induction of agarwood (Mucharromah & Santoso, 2008). Various species of Fusarium were isolated from parts of Indonesia, viz., Fusarium solani, F. tricinctum, F. sambucinum and F. moniliformae, and these were successfully used to induce agarwood formation in Aquilaria malaccensis and A. microcarpa (Budi, Santoso & Wahyudi, 2010; Santoso et al., 2011). Fusarium species have been successfully used to induce agarwood in Aquilaria beccariana (Iskandar & Suhendra, 2012). Study on several isolates of Fusarium from North Kalimantan showed the presence of Fusarium solani, Fusarium sp., F. fujikuroi, F. oxysporum and F. ambrosium (Nurbaya et al., 2014). A study to determine the presence of Fusarium sp. in Aquilaria malaccensis that had undergone fungal inoculation revealed presence of five isolates of Fusarium sp., besides others and the consistency of Fusarium sp. was higher on top stem and could be found in all the parts of the stem. (Lisdayani, Anna & Siregar, 2015). Similarly, Fusasium sp. showed highest presence in endophytic fungi isolated from Aquilaria spp. (Chhipa, Chowdhary & Kaushik, 2017). Turjaman, Hidayat and Santoso (2016) successfully induced agarwood in A. microcarpa, A. crassna and A. beccariana within 75 days of inoculation with Fusarium solani. Fusarium solani has been found highly effective in agarwood initiation in Aquilaria, and is considered the most potent essential oil inducer as it can colonize phloem boundaries within xylem tissues to induce agarwood compounds (Faizal et al., 2017). A combination of treatment with Fusarium solani and nitrogen fertilization has also been suggested to boost agarwood production (Wahyuni, Triadiati & Falah, 2018). Fusarium solani and Fusarium oxysporum have been found responsible for agarwood induction in Indonesia (Zulfendi, Idroes & Khairan, 2019). Fusarium solani has been found to be the most dominant isolate in all artificially inoculated and naturally infected agarwood of Aquilaria malaccensis, and possibility of developing inoculant using Fusarium sp., Polyporales sp. and Schizophyllum commune has been suggested (Ramli et al., 2022). A literature survey showed that 59 endophytic fungal strains of 16 genera induce agarwood production, most of which belong to Fusarium (28 identified strains). Hence, Fusarium was recommended as a good candidate for further studies on fungal induced agarwood production (Du et al., 2022).

Phân tích các nghiên cứu khác nhau về phân lập vi khuẩn và sử dụng chúng trong việc tạo ra trầm hương, chỉ ra rằng Fusarium là loại vi khuẩn phổ biến nhất. Fusarium sp. được phân lập rộng rãi nhất, tiếp theo là Cladophialophora sp. từ Aquilaria sp. (Chhipa & Kaushik, 2017). Các chủng Fusarium sp., đã được đánh giá về tiềm năng tạo trầm hương (Mucharromah & Santoso, 2008). Nhiều loài Fusarium khác nhau đã được phân lập từ các vùng của Indonesia, viz., Fusarium solani, F. tricinctum, F. sambucinum và F. moniliformae, và chúng đã được sử dụng thành công để tạo ra trầm hương ở Aquilaria malaccensis và A. microcarpa (Budi, Santoso & Wahyudi, 2010; Santoso và cộng sự, 2011). Các loài Fusarium đã được sử dụng thành công để tạo ra trầm hương ở Aquilaria beccariana (Iskandar & Suhendra, 2012). Nghiên cứu trên một số chủng Fusarium phân lập từ Bắc Kalimantan cho thấy sự hiện diện của Fusarium solani, Fusarium sp., F. fujikuroi, F. oxysporum và F. ambrosium (Nurbaya et al., 2014). Nghiên cứu xác định sự hiện diện của Fusarium sp. ở Aquilaria malaccensis đã trải qua quá trình cấy nấm cho thấy sự hiện diện của 5 chủng Fusarium sp., bên cạnh những chủng khác và tính nhất quán của Fusarium sp. cao hơn ở phần thân trên và có thể tìm thấy ở tất cả các phần của thân cây. (Lisdayani, Anna & Siregar, 2015). Tương tự, Fusasium sp. cho thấy sự hiện diện cao nhất ở nấm nội sinh phân lập từ Aquilaria spp. (Chhipa, Chowdhary & Kaushik, 2017). Turjaman, Hidayat và Santoso (2016) đã tạo ra trầm hương thành công ở A. microcarpa, A. crassna và A. beccariana trong vòng 75 ngày kể từ khi tiêm Fusarium solani. Fusarium solani đã được tìm thấy có hiệu quả cao trong việc hình thành trầm hương ở Aquilaria và được coi là chất cảm ứng tinh dầu mạnh nhất vì nó có thể xâm chiếm ranh giới phloem trong các mô gỗ để tạo ra các hợp chất trầm hương (Faizal et al., 2017). Sự kết hợp giữa xử lý bằng Fusarium solani và bón phân đạm cũng đã được đề xuất để thúc đẩy sản xuất trầm hương (Wahyuni, Triadiati & Falah, 2018). Fusarium solani và Fusarium oxysporum được cho là nguyên nhân gây ra trầm hương ở Indonesia (Zulfendi, Idroes & Khairan, 2019). Fusarium solani đã được phát hiện là chủng phân lập chiếm ưu thế nhất trong tất cả các loại trầm hương bị nhiễm nhân tạo và nhiễm tự nhiên của Aquilaria malaccensis, và khả năng phát triển chế phẩm sử dụng Fusarium sp., Polyporales sp. và xã Schizophyllum đã được đề xuất (Ramli và cộng sự, 2022). Một khảo sát tài liệu cho thấy 59 chủng nấm nội sinh thuộc 16 chi gây ra sản xuất trầm hương, hầu hết thuộc về Fusarium (28 chủng đã được xác định). Do đó, Fusarium được khuyến nghị là ứng cử viên sáng giá cho các nghiên cứu sâu hơn về sản xuất trầm hương do nấm gây ra (Du và cộng sự, 2022).

CONCLUSION AND WAY FORWARD

Natural agarwood production takes several years and sometimes host-microbe interaction does not take place in the plants, which becomes major problem for the cultivators. With the increasing demand for agar in international market and the decrease in plant population in the wild, many people have started planting it in farmlands in the last two decades. However, in many areas the natural infection does not occur, which necessitates artificial induction of agarwood. Commercial cultivation is already in practice or is recommended in many countries, as plantations or agroforestry systems, as revealed by some of the recent literature from India (Ahmed & Bhagabati, 2021), Bangladesh (Hossain et al., 2021), Malaysia (Elias, Ibrahim & Mahamod, 2017), Indonesia (Insusanty, Ikhawan & Sadjati, 2018), Pakistan (Ullah, 2020), Nepal (Adhikari, Pokhrel & Baral, 2021), Thailand (Jha, 2014), and Vietnam (Persoon & van Beek, 2008). Commercial cultivation needs the support of artificial induction of agarwood, failing which it may not be economically viable. All over the world in areas where agarwood is taken up for commercial cultivation, inoculum is also produced and distributed under various trade names. Some of the commercial formulations in India and abroad are listed in Table 1.

Table 1. Inoculant formulations for artificial induction of agarwood

The commercial cultivation of agarwood needs the support of a reliable inoculation programme. The major areas of research and development related to artificial induction of agarwood are as follows:

(a) In view of large number of endophytes and other pathogens involved in inducing the formation of agarwood, the most virulent ones need to be identified.

(b) Variation in strains within the identified microbes needs to be identified, in terms of their virulence, and the capacity to induce agarwood formation quickly and in large quantity.

(c) Ideal combination of methods-physical, chemical and biological need to be devised for increasing the production of agarwood. It has been suggested that induction of agarwood using a combination of chemical and biological methods may be the optimal technique (Zhuang et al, 2022).

(d) The quality of the product-agarwood chips or oil in terms of the chemical composition and desirable properties of the trade, need to be assessed for various methods of inoculation as well as various inocula used in trade.

(e) The availability of inoculum has to be increased by increasing the facilities for inoculum production, in both the public and private sectors.

(f) The method of inoculation needs to be simplified, so that the farmer can inoculate the trees himself, without any need
to depend on any expert agency.

(g) The inoculum which is now mostly in a liquid form, needs to be converted to forms that can be easily transported or stored, viz., powders, tablets, creams and pastes.

(h) The technology of production now confined to labs, needs to be transferred to commercial producers of inoculum through Material Transfer Agreements, so that the supply of inoculum is decentralized. This has just started in India where the Rain Forest Research Institute has taken the initiative for transfer of microbial strains to commercial labs, but this needs to be expanded on a large scale, to the labs in all those areas where agarwood is planted but natural induction does not take place, as in the case of Kerala and Karnataka, which have about 5 million trees on farmlands.

(i) There may be ideal combinations of host and the pathogen, due to genetic variations in both of them, and these combinations need to be identified for the commercial plantation programmes combining the provenances or genotypes of the host with the pathogen that can lead to maximum production of agarwood.

(j) The search for new pathogens and new strains of already known pathogens, which are more potent should continue.

(k) The multiplication protocol for the pathogens used in inoculum needs to be standardized, as they may lose virulence after repeated multiplication. The mother cultures need to be maintained in a repository for getting back to the original material.

(l) The identified pathogens need to be categorized based on molecular genetics and samples maintained at National repositories, to settle disputes that may arise on the identity of the pathogen and its strain, between the research organizations and the commercial labs.

(m) Quality control of the inoculum is also essential to ensure that sufficient pathogen load is available. The shelf life of the various inocula needs to be standardized.